ライフサイエンス用顕微鏡対物レンズ、ドライタイプ

対物レンズのチュートリアル

このチュートリアルでは対物レンズの様々な機構や表示、およびそれらが示す対物レンズの性能について説明します。

対物レンズの種類と収差補正

対物レンズは一般にその種類によって分類されています。対物レンズの種類によって、対物レンズがどのようにイメージング収差を補正するかが簡単に分かります。 対物レンズの種類によって示される収差補正には、像面湾曲と色収差の2つがあります。

像面湾曲(またはペッツヴァルの湾曲)は、対物レンズの焦点面が球面状に湾曲している状態を表します。この収差があるレンズでは、像面の中心に焦点を合わせると四隅が焦点から外れてしまうため、ワイドフィールド観察やレーザ走査などが困難になります。種類が「Plan」から始まる対物レンズの場合は、その焦点面が平面になるように補正されています。

また結像に際して色収差が生じる場合があり、そのときには1点から放射された光は波長により分散して1点に焦点を結びません。対物レンズによっては、性能と設計の複雑性の間でバランスをとるために、有限数のターゲット波長においてそれらの収差を補正するものがあります。

5種類の一般的な対物レンズをTable 89Aに示します。このうち3種類のみがISO 19012-2: Microscopes -- Designation of Microscope Objectives -- Chromatic Correctionで定義されています。より良い性能を表すために、当社ではISO規格には無い2つの種類を追加しています。　

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カバーガラス(カバースリップ)は含水試料の上にのせる薄いガラスで、イメージングするための平面を作ります。

最も一般的な標準のカバーガラス#1.5は、厚さが0.17 mmに設計されています。製造工程により実際の厚さにはばらつきがある場合があります。対物レンズによっては補正環が付いていますが、これは内部の光学素子の相対位置を調整して、カバーガラスの厚さの違いを補正するのに使用されます。なお、多くの対物レンズにはカバーガラスの厚さの違いを補正する機能は無く、その場合には補正環は付いていません。例えば、カバーガラス#1.5専用に設計されている対物レンズなどがございます。補正環は上の図のような上部にではなく、対物レンズの下部にある場合もあります。

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上のグラフは、632.8 nmの光を使用したときの、カバーガラスの厚さと球面収差の大きさの関係を示しています。厚さ0.17 mmの一般的なカバーガラスを使用する場合、NA 0.40までの対物レンズではカバーガラスによる球面収差が回折限界を超えることはありません。

テレセントリックレンズ

テレセントリックレンズは、物体の距離または視野範囲での位置にかかわらず一定の倍率を保てるよう設計されています。物体の位置にかかわらず物体の寸法に変化はないのでマシンビジョンにおける計測に適しています。

テレセントリックレンズの種類
テレセントリックレンズの性能を得るためには、すべての主光線(軸外の物点から絞り中心を通る光線)が像側、物体側、あるいは両側で光軸に対して平行でなければなりません。

物体側テレセントリックレンズの場合、主光線はレンズの物体側(物体空間)において光軸に対して平行となります。これは、絞り面をレンズの前側焦点面に合せることにより実現し、その結果、入射瞳が無限遠になります。主光線が絞りの中心に向かうので、レンズの物体側の主光線は光軸に沿って平行となります。物体側テレセントリックレンズの例がFigure 119Aに描かれています。

像面側テレセントリックレンズの場合、主光線はレンズの像面側(像空間)において光軸に対して平行となります。これは、絞り面をレンズの後側焦点面に合せることにより実現し、その結果、射出瞳が無限遠なります。主光線が絞りの中心を透過するので、レンズの像面側の主光線は光軸に沿って平行となります。物体側テレセントリックレンズの例がFigure 119Bに描かれています。

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Figure 119A  物体側テレセントリックレンズシステムの光線追跡。主光線(各色の中心光線)がレンズの物体側の光軸に対して平行であるのに対し、像面側の光軸に対しては角度がついています。

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Figure 119B  物体側テレセントリックレンズシステムの光線追跡。主光線(各色の中心光線)がレンズの物体側の光軸に対して平行であるのに対し、像面側の光軸に対しては角度がついています。

両側テレセントリックレンズの場合、前側と後側焦点面が重なる位置に開口絞りが配置され、入射瞳と射出瞳が共に無限遠になるように設計されています。両側テレセントリックレンズの倍率は像ならびに物体の位置に影響されることはありません。当社のテレセントリックレンズはすべて両側レンズの設計となっております。Figure 119Cは、テレセントリックレンズを通る光線の追跡例で、主光線がどのようにシステムを透過するか示しています。

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Figure 119C  両側テレセントリックレンズシステムの光線追跡 主光線(各色の中心光線)がレンズの物体側・像面側の光軸に対して平行なので、物体までの距離にかかわらずレンズの倍率は一定であることを意味します。

標準的なレンズ
標準的なレンズでは入射瞳と射出瞳は無限遠にはないため、主光線が光軸に対して平行にはなりません。この場合、レンズの倍率は物体までの距離ならびに視野範囲での位置によって決まります。Figure 119Dは、標準レンズの光線追跡例です。主光線が像面ならびに物体側の光軸に対して斜めになっています。Figure 119Cと 119Dのレンズはともに同じ仕様のレンズを使用しています。しかし、開口絞りの位置に相違があります。

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Figure 119D  標準レンズシステムの光線追跡 主光線(各色の中心光線)がレンズの物体側・像面側両方の光軸に対して平行ではありません。つまり物体までの距離によってレンズの倍率が変化することを意味します。

イメージ例
Figure 119Eはテレセントリックレンズで撮像した写真、Figures 119Fは、標準的なレンズで撮像した写真です。テレセントリックレンズで撮像したイメージでは、2つのネジが光軸に沿って約45 mm離れているのにもかかわらず、同じ高さに見えます。従来のイメージングシステムにおいては、この2つのネジの高さは異なるように見えるため、寸法の測定結果が正確ではない場合があります。両側テレセントリックレンズを用いたマシンビジョンシステムでは、寸法の計測において優位です。こちらのレンズは例えば当社のマルチセンサービデオ測定システムに組み込むことが可能です。

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Figure 119E  0.128倍率のテレセントリックレンズMVTC23013(旧製品)で撮像した2つのキャップスクリュ。同じサイズのものが同じ物体面にあるように見えますが、実際は光軸に沿って約45 mm離れています。

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Figure 119F  カメラレンズMVL7000(旧製品)で撮像した同規格のキャップスクリュ。MVL7002は同様の性能を示します。画像では、離れているキャップスクリュの投影誤差によって正確な高さの寸法が得られません。

Figure 73A  カメラで画像を表示する場合、システム倍率は対物レンズの倍率とカメラチューブの倍率の積です。三眼鏡筒で画像を表示する時のシステム倍率は、対物レンズの倍率と接眼レンズの倍率の積です。

倍率と試料領域の計算方法

倍率

システムの倍率はシステム内の各光学素子の倍率の積で求めます。倍率のある光学素子にはFigure 73Aの通り、対物レンズ、カメラチューブ、そして三眼鏡筒の接眼レンズが含まれます。なお、各製品仕様に記載されている倍率は通常、すべて同じメーカの光学素子を使用した時のみ有効であることにご留意ください。同じメーカの光学素子を使用していない場合、システムの倍率は下記の通り、まず対物レンズの有効倍率を求めたあと算出する必要があります。

下記の例をお手持ちの顕微鏡に応用する場合には、上のMagnification and FOV Calculator(赤いボタンをクリック)をダウンロードしてご使用ください。こちらの計算用エクセルファイルはマクロを使用したスプレッドシートになっています。計算を行う際はマクロを有効にする必要があります。マクロを有効にするには、ファイルを開いて、上部にある黄色いメッセージバー上の「編集を有効にする」ボタンをクリックしてください。

例1:カメラの倍率
試料をカメラでイメージングする場合、イメージは対物レンズとカメラチューブによって拡大されます。倍率が20倍のNikon製対物レンズと倍率が0.75倍のNikon製カメラチューブを使用している場合、カメラの倍率は20倍 × 0.75倍 = 15倍となります。

例2:三眼鏡筒の倍率
三眼鏡筒を通して試料をイメージングする場合、イメージは対物レンズの倍率と三眼鏡筒内の接眼レンズによって拡大されます。倍率が20倍のNikon製対物レンズと接眼レンズの倍率が10倍のNikon製三眼鏡筒を使用している場合、接眼レンズでの倍率は20倍 × 10倍 = 200倍となります。なお、Figure 73Aのように接眼レンズでの像はカメラチューブを通りません。

メーカが異なる対物レンズと顕微鏡を使用する場合

倍率は根源的な値ではなく、特定のチューブレンズの焦点距離を推定して計算し、導き出す値です。Table 73Bのように各顕微鏡メーカはチューブレンズに様々な焦点距離を設定しています。そのため異なるメーカの光学素子を組み合わせる場合、システムの倍率を算出するには対物レンズの有効倍率を計算する必要があります。

対物レンズの有効倍率は式(1)で求められます。

ここでDesign Magnificationは対物レンズに印字されている倍率、f_{Tube Lens in Microscope}は使用する顕微鏡内のチューブレンズの焦点距離、f_{Design Tube Lens of Objective}はDesign Magnificationを算出するために対物レンズのメーカが使用したチューブレンズの焦点距離です。焦点距離はTable 73Bに記載されています。

Leica、Mitutoyo、Nikonならびに当社ではチューブレンズの焦点距離は同じです。これらのメーカの光学素子を組み合わせた場合、倍率の変換は必要ありません。対物レンズの有効倍率が算出されたら、上記のようにシステムの倍率が計算できます。

例3:三眼鏡筒の倍率(異なるメーカを使用)
三眼鏡筒を通して試料をイメージングする場合、イメージは対物レンズの倍率と三眼鏡筒内の接眼レンズによって拡大されます。この例では倍率が20倍のOlympus製対物レンズと接眼レンズの倍率が10倍のNikon製三眼鏡筒を使用します。

式(1)とTable 73BによりNikon製顕微鏡内のOlympus製対物レンズの有効倍率を下記の通り計算しました。

Olympus製対物レンズの有効倍率は22.2倍で、三眼鏡筒の接眼レンズの倍率は10倍なので、接眼レンズでの倍率は、22.2倍 × 10倍 = 222倍となります。

Figure 73C  カメラでイメージングする試料領域

カメラでイメージングする試料領域

試料をカメラでイメージングする場合、試料領域の寸法はカメラセンサの寸法とシステム倍率を使用して下の式(2)で求められます。

カメラセンサの寸法はメーカが提供しています。またシステム倍率は対物レンズの倍率とカメラチューブの倍率の積です(例1をご参照ください)。必要に応じ、対物レンズの倍率を例3のように調整します。

倍率が高くなればなるほど分解能も向上しますが、視野は狭くなります。倍率と視野の関係性についてはFigure 73Cでご覧いただけます。

例4:試料領域
当社のサイエンティフィックカメラ1501M-USB(旧製品)内のカメラセンサの寸法は8.98 mm × 6.71 mmです。このカメラを例1のNikon製対物レンズと三眼鏡筒に使用した場合、システム倍率は15倍となります。イメージングの領域は下記の通りになります。

試料領域例

Figure 73D～73Fのマウス腎臓の画像はすべて同じ対物レンズとカメラを使用して取得しました。ただし、カメラチューブのみ違う製品を使用しています。Figure 73D～73Fの画像にいくにつれカメラチューブの倍率が下がっていますが、視野が広くなる分、細部も小さくなり見にくくなることが分かります。

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Figure 73D  倍率1倍のカメラチューブで取得(型番 WFA4100)

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Figure 73E  倍率0.75倍のカメラチューブで取得(型番 WFA4101)

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Figure 73F  倍率0.5倍のカメラチューブで取得(型番 WFA4102)

分解能のチュートリアル

多くのイメージングにおいて、対物レンズの分解能は重要なパラメータです。このチュートリアルでは、対物レンズの分解能を定義するために使用されるさまざまな約束事について説明します。当社のサイトに掲載しているすべてのイメージング用対物レンズには、レイリー分解能の理論値を示しています。ここに示すそれ以外の基準に基づく記述方法は、情報提供の目的で提示しています。

分解能

対物レンズの分解能は、物体の近接した構造を識別する性能を表します。これは多くの場合、2つの点光源で構成される物体を想定し、これらの2つの点光源を分解できる最小間隔を求めることによって理論的に定量化します。点光源をイメージングしてみると、単体の明るい点となることはなく、回折の影響を受けて幅の広い強度プロファイルとして現れます。このプロファイルはエアリーディスクとして知られ、強度の高い中央のピークと、それを囲む強度の低いリングから構成されます。そのため、2つの互いに近接する点光源から生成されるイメージは、2つの重なり合うエアリーディスクプロファイルから構成されることになります。したがって、対物レンズの分解能は2つのプロファイルを一意的に識別できる最小間隔によって決めることができます。どのような状態であれば2つのプロファイルが分解されたとするのかという点について、基本的な基準はありません。しかし、実際に使用されている基準は幾つかあります。顕微鏡イメージングの分野で最も一般的に使用されている基準としては、レイリーの基準とアッベの基準の2つがあります。その他の基準としては、天文学の分野でより一般的に用いられているスパローの基準があります。

レイリーの基準

レイリーの基準では、一方の強度プロファイルの最初の極小値の位置が、もう一方の強度プロファイルの最大値の位置と一致したときに、2つの重なり合うエアリーディスクプロファイルが分解されたとします[1]。エアリーディスクの最初の強度の極小値は、中心の最大値から半径1.22λf/Dの位置に生じることを示すことができます。ここで、λは光の波長、fは対物レンズの焦点距離、Dは入射瞳の直径です。したがって、開口数(NA = 0.5*D/f)を用いて、レイリー分解能は次の式で表されます。

r_R = 0.61λ/NA

レイリー分解能に等しい距離だけ離れた2つのエアリーディスクの理想的なイメージをFigure 109Aに示します。光源はインコヒーレント光源であると仮定しています。この図の2つの最大値を通る水平な線に沿って、その強度分布をグラフ化するとFigure 109Bが得られます。この強度プロファイルの図における垂直の点線により、一方のエアリーディスクの最大値の位置と、もう一方のエアリーディスクの最初の極小値の位置が一致していることが分かります。2つの最大値の間には極小値があり、それにより2つの白いピークの間には灰色の領域が現れています。

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Figure 109B  垂直の点線により、一方の強度プロファイルの最大値の位置が、もう一方の強度プロファイルの最初の極小値の位置と一致していることが分かります。

Figure 109A  2つの点光源がレイリー分解能によって分離されたとき、それらは分解されたとみなします。2つの白いピークの間に灰色の領域がはっきりと見えます。

当社では、ウェブサイトに掲載しているすべてのイメージング用対物レンズについて、そのレイリー分解能の理論値を個別の製品説明ページでご提示しています。

アッベの基準

アッベの理論では、画像形成を回折の二重プロセスとして表現します[2]。そのフレームワークでは、2つの構造が距離dだけ離れているとき、それらを分解するには少なくとも0次と1次の両方の回折光が対物レンズの開口部を通過する必要があるとします。1次回折光はsin(θ₁) = λ/dで表される角度θ1の方向に現れるため、分解可能な最小の物体間距離、すなわち対物レンズの分解能はd = λ/n*sin(α)で与えられます。ここで、αは対物レンズの半開口角、係数nはイメージング媒体の屈折率です。この結果は、実際の限界に対して2倍の過大評価をしています。理由は、0次光とともに対物レンズを通過しなければならない1次光は少なくとも1つあればよいわけですが、ここでは両方の1次光を通過させているためです。上記の結果を2で除し、さらに開口数の定義(NA = n*sin(α))を使用することで、有名なアッベの分解能限界が得られます。

r_A = 0.5λ/NA

Figure 109Cは、アッベの分解能限界で分離された2つのエアリーディスクを表しています。レイリー限界と比較して、原点における強度の減少を識別するのは大分困難になります。Figure 109Dの強度分布図を見ると、中心の強度の減少はわずか2%です。

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Figure 109D  このグラフでは2つの最大値の間に小さな強度の減少が見られます。

Figure 109C  アッベの分解能限界によって分離された2つの点光源。最大値と中央の極小値の間のコントラストは観察可能ではありますが、レイリー限界と比較するとはるかに弱くなっています。

スパローの基準

2つの点光源の間の距離がレイリーまたはアッベの分解能基準に対応する場合、重ね合わせられた強度プロファイルにおける2つの最大値の間の原点に極小値が見えます。そういった意味では、これらの評価基準では2つの点光源を分解することができています。しかし、点光源間の距離がアッベの分解能限界を超えてさらに小さくなると、2つの独立した最大値は1つの中央の最大値に一体化され、2つの光源からの寄与を個々に分解することができなくなります。スパローの基準では、中央の極小値が中央の最大値に変化したときに分解能限界に達したとします。

スパローの分解能限界では、重ね合わせられた強度プロファイルの中心は平坦になります。これは、位置に関する微分係数が原点でゼロになることを意味します。しかし、原点でのこの1次微分係数は、重ね合わせられた強度プロファイルの極小値または最大値であるため、常にゼロです(厳密に言えば、これは2つの光源の強度が等しい場合にのみ当てはまります)。従って、原点の強度が極小値から最大値に変化するときにスパローの分解能限界に到達したことになるため、このときに2次微分係数の符号が正から負に変化する必要があります。このようにスパローの基準は2次微分係数に課される条件となり、2次微分係数がゼロのときに分解能限界に到達することになります[3]。 この条件を2つのエアリーディスクが重ね合わせられた強度プロファイルに適用すると、スパロー分解能が次のように得られます。

r_S = 0.47λ/NA

Figure 109Eは、スパローの分解能限界の距離に置かれた2つのエアリーディスクのイメージを示しています。上記のように2つのピークの間では強度が一定であり、原点での強度のくぼみはありません。Figure 109Fでは、原点付近で強度が一定であることを確認できます。

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Figure 109F  スパローの分解能限界では、重ね合わせられた強度分布は原点付近で一定になります。ここではスケールが1に規格化されています。

Figure 109E  スパローの分解能限界によって分離された2つのエアリーディスクのプロファイル。レイリーやアッベの限界とは異なり、原点で強度は減少しません。

参考文献
[1] Eugene Hecht, "Optics," 4th Ed., Addison-Wesley (2002)
[2] S.G. Lipson, H. Lipson, and D.S. Tannhauser, "Optical Physics," 3rd Ed., Cambridge University Press (1995)
[3] C.M. Sparrow, "On Spectroscopic Resolving Power," Astrophys. J. 44, 76-87 (1916)