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光ピンセット(光トラップ)顕微鏡システム


光ピンセット(光トラップ)顕微鏡システム
  • Available as Full System Including Microscope or Add-On System for an Existing Microscope
  • Sub-Piconewton Force Measurement and Nanometer Position Detection
  • Creates Multiple Computer-Controlled Traps in XYZ

 



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DNA
光ピンセットを用いてプローブビーズを保持し、DNA鎖に働く力の測定ができます。

特長

  • 1064 nm CW 出力安定化レーザ
  • マイクロ~ナノスケール粒子の光学的操作
  • それぞれをガルバノステアリングミラーで操作するデュアルレーザービームパス
  • PCによる光トラップ位置のXYZ制御
  • 後方焦点面において位置およびトラップ力の高分解能測定 
  • 250 kHz位置検出器、逆バイアス付き
  • 下記に関するカスタム構成については当社までお問い合わせください。
    • 波長や出力の異なるレーザ
    • 既存の顕微鏡へのアドオン

光ピンセット(光トラップ)は、マイクロ~ナノスケールの物体の空間的な閉じ込め、移動、および特性の測定を行うために一般的に用いられる科学ツールです。微視的なコロイドプローブ(例:石英ガラスやポリエステル球)の位置変化を観察するための超高感度なプラットフォームを提供し、さらにプローブ球に働く力を算出することができます。当社の光ピンセット(光トラップ)顕微鏡システムは、システムをすぐにご使用になりたいお客様向けに設計されています。低ノイズ、低ドリフトのシステムで、様々な用途でご使用いただけます。システムは共焦点顕微鏡法やラマン分光法などのイメージング法と組み合わせてご利用いただくことができます。

当社の標準的な光ピンセット(光トラップ)システムには、Nikon製倒立顕微鏡Eclipse Ti2-A、1064 nmトラップステアリングモジュール、ガルバノミラーで制御するデュアルレーザービームパス、および力・位置測定モジュールが含まれます。このシステムは、Nikon Eclipse Ti顕微鏡のサイドポートや落射蛍光ポートなどの複数のポートに対応できるように設計されています。また、他のメーカも含め、既存の倒立顕微鏡のアドオンとして構成することも可能です。レーザの波長や出力などについて、ご要望に応じてカスタイマイズすることもできます。詳細については当社までお問い合わせください。

光ピンセット(光トラップ)システムの生物学的用途としては、2D表面パターニング(樹状突起の成長誘導など)や、単一細胞の精密3Dマイクロマニュピュレーション("Direct Writing"など)があります。装置に力測定モジュールが含まれているため、DNAやたんぱく質などの分子モータや単一分子に関する良く知られた研究出版物の分析結果と矛盾のない位置や力の測定ができます。細胞骨格ネットワークの応力-ひずみ関係(単一細胞内部の粘弾性特性)も調べることが可能です。ご要望により、物質の貯蔵弾性率や損失弾性率の計算を光ピンセット制御ソフトウェアに組み込むことが可能ですので、その際は当社までお問い合わせください。生物学以外の用途では、液滴の合体に関する研究、マイクロレオロジー、結晶成長の研究、多粒子系コロイドにおける粒子間相互作用の測定などがあります。このような光ピンセット(光トラップ)の使い方に関する論文については「Suggested Reading」のタブをご覧ください。

当社では、用途に応じて様々なご要望にお応えできるように、
お客様のニーズに合わせたご提案を心掛けています。

ご意見・ご要望、またはご質問などございましたら当社までお気軽にご連絡ください。

Components
Complete Optical Tweezers Microscope SystemAdd-On Optical Tweezers Microscope System
  • Nikon Eclipse Ti2-A Inverted Microscope
  • 1064 nm Trapping Module, Dual Beam Path
  • Galvos for Each Path, or for a Single Path
  • Force Measurement Module for Dual or Single Beam Paths
  • High-Resolution XYZ Piezo Stage
  • Trapping Objective and Condenser
  • CMOS Camera (Options Available)
  • Software Package with Force Module Option
  • Computer and Dual Monitor
  • 1064 nm Trapping Module, Dual Beam Path
  • Force Measurement Module for Dual or Single Beam Paths (Optional Only)
  • Trapping Objective (Options Available with Consideration to Aberration Correction and Transmission)
  • CMOS Camera (Options Available)
  • Beam Dump Module
  • Software Package
  • Computer and Dual Monitor
Specifications
Optical Trap Specifications
Center Wavelength1064 nm 
Emission Bandwidth< 0.25 nm
Laser Head Output Power5 W
Laser Power Noise (RMS)< 0.2% (Under Optimal Environmental Conditions)
Beam Diameter at Objective Back Aperture8 mm
Trap Scan Area80 μm x 80 μm (With 1.3 NA)
Number of Independent Trap Beam Paths2
Maximum Number of Stable Traps per Beam Path15
Microscope Specifications
Inverted MicroscopeNikon Eclipse Ti2-A
FocusingVia Nosepiece, Manual or Motorized
CondenserLWD 0.52 NA
Objective1.3 NA , Oil Immersion (Other Options Available)
Force Module Specifications
Travel Range200 µm x 200 µm x 200 µm
Stage Resolution (Closed Loop)1 nm
DetectionDual Path Position Sensing Detector Module with Reverse Bias
Data Acquisition16 Bits, 10 ns Timing Resolution
Computer Specifications
Operating SystemWindows® 10 Professional (English Version)
Disk Space500 GB SSD + 1TB SSD
MonitorDual Screen, 21.5" (54.6 cm)
RAM32 GB
Video RAM512 GB

レーザービームの焦点で粒子を捕捉


400年ほど前の1619年頃、ケプラーは太陽光により彗星の尾が曲げられていることを報告しています。人類はその後数世紀の間、光は物質に力を及ぼすことができると唱えてはきましたが、光により微視的な(あるいはそれ以下の)レベルの力を発生させ1-5、それを高い分解能で測定できるようになった1,6-13のは、この半世紀のことです。光ピンセットによって、コロイド科学における粒子間相互作用の測定14や、単一分子化学における力の測定6-8,10,11などが実現してきました。光ピンセット、または光トラップでは、どちらも通常高NA対物レンズで得られる集光ビームが使用されます。光トラップを成功させるためには、レーザ波長における対物レンズの収差補正と透過率が重要であることがよくあります。対物レンズで得られるレーザ光の回折限界における焦点体積では、マイクロメートルサイズの粒子はレーザ光からピコ~ナノニュートンの力を受けます。

1960年代後半、Bell Labs研究所のArthur Ashkin氏が、光双極子力により粒子を隔離し、操作できることを初めて発見しました。 Ashkin氏は、その後Steven Chu氏をはじめ、Joseph Dziedzic氏、John Bjorkholm氏、そしてAlex Cable(ソーラボ社の創業者であり現CEO)などと光トラップの実験を始めました2-5。光の放射圧と勾配力による物質の操作技術は、世界の物理学界や化学界で大きな注目を浴びました。1997年、Chu氏はClaude Cohen-Tannoudji氏、William Phillips氏とともに「レーザ光により原子を冷却および補足する手法の開発」によりノーベル物理学賞を受賞しました。 2018年にはAshkin氏が「光ピンセットの開発とその生物システムへの応用」によりノーベル物理学賞を受賞しました。これらの初期の考案者によって開発された技術のエッセンスは、今日の光ピンセット研究の核となって残っています。光による物質の捕捉技術は、バイオエンジニアリング、生物物理学、物質科学、基礎コロイド物理学などさまざまな分野で重要なツールとなっています。これは光ピンセットでは様々な種類の粒子を操作することができ、さらにサブピコ~ナノニュートンの力の測定とナノメートルスケールでの位置測定が同時にできるためです。 


  1. Jones, P.H., Maragò, O.M. and Volpe, G., 2015. Optical tweezers: Principles and applications. Cambridge University Press.
  2. Ashkin, A., Dziedzic, J.M., Bjorkholm, J.E. and Chu, S., 1986. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics letters, 11(5), pp.288-290.
  3. Chu, S., Hollberg, L., Bjorkholm, J.E., Cable, A. and Ashkin, A., 1985. Three-dimensional viscous confinement and cooling of atoms by resonance radiation pressure. Physical review letters, 55(1), p.48.
  4. Chu, S., Bjorkholm, J.E., Ashkin, A. and Cable, A., 1986. Experimental observation of optically trapped atoms. Physical review letters, 57(3), p.314.
  5. Raab, E.L., Prentiss, M., Cable, A., Chu, S. and Pritchard, D.E., 1987. Trapping of neutral sodium atoms with radiation pressure. Physical review letters, 59(23), p.2631.
  6. Greenleaf, W.J., Woodside, M.T. and Block, S.M., 2007. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 36, pp.171-190.
  7. Perkins, T., 2009. Optical traps for single molecule biophysics: a primer. Laser & Photonics Reviews, 3(1-2), pp.203-220.
  8. Svoboda, K. and Block, S.M., 1994. Biological applications of optical forces. Annual review of biophysics and biomolecular structure, 23(1), pp.247-285.
  9. Svoboda, K., Schmidt, C.F., Schnapp, B.J. and Block, S.M., 1993. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature, 365(6448), p.721.
  10. Moffitt, J.R., Chemla, Y.R., Smith, S.B. and Bustamante, C., 2008. Recent advances in optical tweezers. Annu. Rev. Biochem., 77, pp.205-228.
  11. Neuman, K.C. and Block, S.M., 2004. Optical trapping. Review of scientific instruments, 75(9), pp.2787-2809.
  12. Perkins, T., 2009. Optical traps for single molecule biophysics: a primer. Laser & Photonics Reviews, 3(1-2), pp.203-220.
  13. Gittes, F. and Schmidt, C.F., 1998. Interference model for back-focal-plane displacement detection in optical tweezers. Optics letters, 23(1), pp.7-9.
  14. Grier, D.G., 2003. A revolution in optical manipulation. Nature, 424(6950), p.810.

光トラップの理論


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図1:粒子の大きさと散乱の波長領域(参考文献8をもとに作成)

光トラップ(捕捉)の理論は、物質と光の物理的相互作用のモデリングと関連して、長年にわたり進化を遂げてきました。光トラップ力を記述する主な数学的理論としては、レイリーとミーによる2つの理論があります(図1参照)。レイリーの理論では、散乱物質を非常に小さな電気双極子としてモデル化し、光子はそれらの電気双極子と弾性相互作用をします1,2。このモデルは、散乱粒子の直径が光の波長と比べて小さく、かつ散乱粒子が光を吸収しない場合によく機能します。レイリー散乱による力は、入射光の電場によって電気双極子が誘起され、それに続いて光が再放射されることによります。レイリー散乱モデルは、散乱粒子の直径が光の波長のおおよそ1/10以下であれば適用することができます。さらに、入射するレーザ光の電場には空間的な勾配があるため、散乱粒子に対して勾配力が作用します1,2。しかし、粒子径が波長の1/10より大きい場合、粒子のある1点で散乱された光の波と、同じ粒子のほかの点で散乱された光の波の位相が異なる場合があります。それらの異なる波は互いに干渉しあうため、粒子周りの散乱光の分布は、レイリー散乱モデルで通常見られるような対称な形ではなくなります。ここからは、ミー散乱の理論がより望ましいモデルとなります1,3


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図2:光トラップにおける力。幾何光学モデルにおいては、光線1と光線2(黄色の矢印)で生じる力はそれぞれF1とF2(黒色の矢印)です。焦点の手前の粒子(左)には前方への合力、焦点の奥の粒子には後方への合力が作用します。

ミーの理論では、散乱粒子の大きさだけでなく、散乱粒子の屈折率と周辺媒質の屈折率も考慮します。当初は様々な大きさの非吸光物質に適用されるモデルでしたが、現在ではそこから派生したモデルが吸光物質やコーティングされたハイブリッド粒子にも適用されるようになっています。ミー散乱理論には粒子の大きさについての上限はなく、大きな粒子に対する幾何光学とも整合しています(下記参照)。レイリー散乱モデルは、波長よりも非常に小さい粒子に対して適用されるミー理論の特別なケースと考えることができます。

粒子の大きさがレーザ波長と同程度、つまりミー散乱とレイリー散乱の境界付近では、散乱方程式を簡略化したこれらのモデルの近似式は適用できなくなり、電磁場解析はさらに 複雑になります
1,3-7。これらの理論について詳細は「Suggested Reading(推奨文献) 」のタブをご覧ください。


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図3:光トラップ内の粒子には勾配力と散乱による放射圧が作用します。

トラップのメカニズムの多くは、ミー理論で複雑な計算をするかわりに、シンプルな光線光学あるいは幾何光学で概算することができます1。捕捉された粒子の直径が波長よりも大きい場合には、幾何光学が適用できます。このモデル(図2参照)では光線(黄色の矢印)が粒子を通ると屈折しますが、光線が向きを変えたときに運動量が保存されるため、屈折のたびに光から粒子に運動量が移動します。粒子が中心位置から少し外れ、レーザービームの焦点から数マイクロメートルの位置にある場合は、粒子が3次元的に焦点に向かって動くように、屈折する光線から粒子に運動量が伝達されます。周囲の流体のブラウン力によって動かされる粒子の平衡位置(XYZ)は、集光ビームの中心近傍(通常は数百ナノメートル以内)になります。

Z軸方向(対物レンズを通るレーザ光の伝搬方向で、通常は顕微鏡のXY像面に対して垂直)の力については、さらに考慮すべき点があります。光は粒子内(粒子と溶媒の境界面)で後方に散乱されるため、光から粒子に何度も運動量が伝達され、その結果としてビームの前方に向けて散乱力が加わります(球状粒子の場合)。この散乱力は「放射圧」とも呼ばれ、これにより粒子のZ位置は常にビームの焦点中心よりも若干上側にずれます(図3参照)。

従って、倒立顕微鏡の像面に正確に焦点が合うようにアライメントされた光ピンセットでは、像面よりも若干上の位置に粒子が補足される傾向があります。3次元の全方向に作用する勾配力は、散乱力と競合する関係にあります。 実際には、この競合は光トラップを構成する対物レンズの特性によって影響を受けます。NAが大きく、最高度の収差補正がなされたレンズを使用することは、放射圧よりも強い勾配力が優位となるような安定したトラップを形成するのに寄与します。最終的に、これらの光によるすべての力成分が(流体に浮遊している)粒子に作用しますが、その合力FNETは位置によって変化し、粒子は絶対的な静止状態にはなりません。その理由は、流体のランダムな熱運動が、ビーズの位置を光トラップの中心位置から若干ずらすのに十分なエネルギーを有するためです。これはビーズ表面と流体との摩擦力で運動が減衰する場合でも同様です。

力の解析

当社の力測定モジュールは、プローブビーズの位置変化Δxを定量化することで動作します。光トラップ内の質量mBのコロイド状プローブビーズに作用している力を測定する場合には、まず位置の時間変化を測定する必要がありますが、これは次のようなプローブビーズの1次元での速度と加速度に関係します。

これにより、ニュートンの運動の第2法則を使って、容易に位置の時間変化を力に関連づけることができます。

光トラップ内のビーズは、常に多方向から様々なナノ~マイクロスケールの力を受けるため、プローブビーズに作用する個々の力についての情報を抽出するには、より高度な方法が必要になります。幸いにも、コロイドビーズの運動のデータから個々の力を抽出する一般的な方法が存在します。例としては、等分配、マクスウェル-ボルツマン分布、平均二乗変位、抗力、自己相関、光の運動量、パワースペクトル分布解析(PSD)などの法則や技術を用いる方法があります。当社の力測定モジュールでは、力の主な校正方法として、ランジュバン方程式とPSD解析を用います。この方法では、機器や環境からのノイズにも対処することができます。

この解析では、ランジュバン力ともよばれるFL (x,t)が、捕捉されたプローブビーズに実際に働く力(合力)になります。レーザによるトラップ力、ビーズと流体間の摩擦力、および流体の熱運動による力を合計したものと等しくなります。γをビーズの抗力係数(γ = 6πηa)、ηを流体粘度、aをビーズの半径、κをフックの法則におけるばね定数(ビーズのレーザ光との相互作用は線形ばねによる復元力FTRAPで近似)、X(t)を時間とともにランダムに変化する流体の熱運動による力としたとき、トラップ内のプローブビーズに加わる全合力FLは以下のようになります。

この全合力とビーズの慣性力FNET (x,t)を組み合わせて、トラップ内のビーズのランジュバン方程式を作ります。

ブラウン運動と流体の抗力により、一般的なビーズの力測定においては、ビーズの慣性力は減衰すると想定されます。そのため、この力測定の時間スケールにおけるプローブビーズの慣性力はわずかである(方程式内の他の項と比較してゼロに等しい)と想定するのは妥当です。従って、当社の力測定モジュールの校正においては、過減衰ランジュバン方程式を中心としたものになります。

さらに、この方程式は、以下のビーズに関するストークス-アインシュタインの拡散定数D、レーザ光とビーズの相互作用ポテンシャルU、およびホワイトノイズ関数W(t)を用いて、
Diffusion Constant Trapping Force Equation
次のように書き変えることができます。
この運動方程式から、1次元でのプローブビーズの位置の変化率について、以下のことが言えます。

1)ビーズの質量に依存しない 
2)ビーズの流体との摩擦による抗力に反比例する
3)レーザ光とビーズの相互作用ポテンシャルエネルギーの位置に対する変化率に比例する
4)線形ばね定数に比例する(フックの法則で近似される範囲内でのビーズの運動を想定)
5)拡散定数(温度Tの関数)に比例する

次に上記の運動方程式をフーリエ変換し、フーリエ変換された複素数の位置データxkに少し代数処理を行うと、ビーズの運動を周波数の関数として表すローレンツ関数が得られます。 パワースペクトルの期待値Pfexpはカーブフィッティングパラメータfc(コーナー周波数)およびストークス-アインシュタインの拡散定数の期待値Dexpと関係しており、これらからばね定数(K = 2πγfc)や自由拡散定数D、および光トラップの強さやビーズ周囲の局所的な環境に関する情報を表すその他の校正パラメータを求めることができます。

データ収集の全期間ttotal中に記録された位置の変化は、校正されたディテクタの感度を用いて、ディテクタの電圧からナノメートル単位に変換して取得することができます。 ピコニュートン単位の力は、新しい外力の影響下に置かれたプローブビーズのその後の位置の変化x(t)に、校正されたばね定数を乗じることで得られます。


  1. Jones, P.H., Maragò, O.M. and Volpe, G., 2015. Optical tweezers: Principles and applications. Cambridge University Press.
  2. Ashkin, A., Dziedzic, J.M., Bjorkholm, J.E. and Chu, S., 1986. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics letters, 11(5), pp.288-290.
  3. Bohren, C. F., and D. R. Huffman 1983. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. Wiley, New York.
  4. Almaas, E. and Brevik, I., 1995. Radiation forces on a micrometer-sized sphere in an evanescent field. JOSA B, 12(12), pp.2429-2438.
  5. Barton, J.P., Alexander, D.R. and Schaub, S.A., 1988. Internal and near-surface electromagnetic fields for a spherical particle irradiated by a focused laser beam. Journal of Applied Physics, 64(4), pp.1632-1639.
  6. Zemánek, P., Jonáš, A. and Liška, M., 2002. Simplified description of optical forces acting on a nanoparticle in the Gaussian standing wave. JOSA A, 19(5), pp.1025-1034.
  7. Ren, K.F., Greha, G. and Gouesbet, G., 1994. Radiation pressure forces exerted on a particle arbitrarily located in a Gaussian beam by using the generalized Lorenz-Mie theory, and associated resonance effects. Optics communications, 108(4-6), pp.343-354.
  8. Kostylev, V.I., 2007. Scattering Fundamentals. Bistatic Radar: Principles and Practice, pp.193-223.
  9. Berg-Sørensen, K. and Flyvbjerg, H., 2004. Power spectrum analysis for optical tweezers. Review of Scientific Instruments, 75(3), pp.594-612.
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図1:ThorSync位置取得パネル

光ピンセットはコロイド粒子と相互作用し、粒子に対してレーザー光の焦点に向かう力を加えますが、その力はレーザ光の焦点から粒子までの距離に比例します(ここでは、トラップ中心からの変位は小さいものと仮定しています)。捕捉された粒子が光から力を受けるとき、フォトダイオードに入射しているレーザの散乱光は、過減衰状態でブラウン運動する粒子によってその向きを変えられます。 これによりフォトダイオードでは観測可能な電圧変化が生じますが、これが校正されていれば、捕捉された粒子のナノスケールでの位置変位と数学的に関連づけることができます。当社の光ピンセットシステムでは、この散乱ビームを力測定モジュールで収集します。モジュールではビームの干渉パターンが位置検出用のフォトダイオードによって電気信号に変換されます。これにより文献で定義されている後焦点面干渉法が確立されます2-4。捕捉された粒子の位置を表すモジュールからの時系列アナログ電圧信号はデジタル化され、National Instruments™社のデータ収集カードで記録されます。そのデータはThorSync™ソフトウェアで解析され、ナノメートルスケールでの位置とサブピコニュートンの力を算出することができます。

当社の光ピンセット顕微鏡システムでは、標準的な顕微鏡スライドチャンバーを用いてin situで試料の力測定を行うことができます。力測定モジュールは、補足されたプローブ粒子の位置を2次元(XY)で検出します。一方、CCDカメラで独立した3次元(XYZ)イメージングも可能です。右のパネルに示しているのは、後焦点面の力モジュールディテクタからのXおよびYに対応する電圧信号で、捕捉されたシリカビーズの重心の運動を表しています。それら2つの信号チャンネルの下側のチャンネルはレーザ光パワーの時系列データですが、ノイズはミリワットレベルで一定であり(5 Wのレーザヘッドを使用)、またパワーのドリフトはゼロに近いことが分かります。当社の光ピンセットシステムにおけるレーザ光のポインティングとパワーの安定性は、レーザ光がレンズや他の電気光学部品を通過するため、システムの熱的および電気機械的な特性に依存します。適切にウォームアップされていれば、分程度のタイムスケールでナノメートルスケールのトラップ安定性が得られます。これにより、当社のシステムを用いて、分子モータや単分子、あるいは拡張ポリマーネットワークの研究において分程度の観測時間を得ることができます1,2,5-10

力測定の正確さは位置検出方法の感度と力定数の校正に依存します。これらは共にレーザ光のパワーとポインティングの安定性、および粒子と周囲流体の特性(粒子のサイズ、形状、組成、および粒子と流体の誘電特性など)に依存します。光ピンセットの位置や力の測定システムの使い方は、ギターやアンプやスピーカーを特定の種類の音楽にチューニングするのと似ています。 例えば、研究者は一般的にビーズのサイズ、流体の粘度、または試料チャンバの寸法などのパラメータを調整して、位置や力の分解能、位置の動作範囲、あるいはトラップの剛性などに関連する測定性能を最大化させます。当社の光ピンセットを使用した試料の校正は、より良いデータを収集する上で中心的な役割を果たします。力定数を校正する一般的な方法には、パワースペクトル解析、等分配則、ストークスの抵抗則などを利用する方法があります1,6

ビーズの運動をシンプルに記述する等分配則は、静止しているトラップの熱力学がベースになっています。フック法則に従うトラップに捕捉された粒子の平均ポテンシャルエネルギーは、溶媒の熱エネルギーと等しくなります(局所的な粘度の値は想定されていません)。

Potential Energy of Hookean Trap

しかし等分配則法は、系統的な測定ノイズを評価して除去するには良い方法ではありません。そのため、この実験を行う人は、一般に数学的な変換手法を用います。


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図2:ThorSyncパワースペクトル

当社の位置解析法の基礎となっている変換手法の1つは、一般的にも使用されているパワースペクトル11に基づいた校正方法です。このパワースペクトルは、捕捉された粒子の位置(ブラウン運動によって動かされる)の時系列データをフーリエ変換して得られる、周波数分布関数です。これは、溶媒の粘性によって過減衰の状態にある調和ばねの応答に適用するのに適しています。パワースペクトルの関数形は以下のような式になります。

Functional Form of the Power Spectrum

ここでPfexpはパワースペクトルの振幅、 fc はトラップの特徴的なコーナー周波数、Dexpはディテクタの感度を考慮したビーズのストークス-アインシュタイン拡散定数の期待値です。約2分間で取得されたパワースペクトルとその初期カーブフィッティング(パワースペクトルの補正なし) の例を左に示します。ここで、15 Hz未満の低周波ノイズは、測定に混入したわずかな環境振動に起因する可能性があります。このスペクトルは、実験をする前に、データからどのようにハードウェアおよび環境(テーブルの除振)について診断できるかを示しています。

3番目として、これもまた普及している力の計算方法ですが、ストークスの抵抗則を使う方法があります。この方法では試料ステージ(従って流体も)、またはトラップそのものをさまざまな速度で移動します。その後、速度を有する流体が粒子に作用する粘性抗力と、光トラップによる力とのバランスを計算します。等分配則法とストークス抵抗則法は、何れもパワースペクトル解析法とは若干異なり、それぞれ独自の物理的な仮定があります。そのため、ユーザが定義する方法でも、多くの標準的な光ピンセットの実験で機器と試料を校正するのに十分な方法となる場合があります。

当社のソフトウェアにおける様々な解析方法(既存あるいはカスタマイズ)についてのお問い合わせは、当社までご連絡ください。


参考文献

  1. Jones, P.H., Maragò, O.M. and Volpe, G., 2015. Optical tweezers: Principles and applications. Cambridge University Press.
  2. Neuman, K.C. and Block, S.M., 2004. Optical trapping. Review of scientific instruments, 75(9), pp.2787-2809.
  3. Gittes, F. and Schmidt, C.F., 1998. Interference model for back-focal-plane displacement detection in optical tweezers. Optics letters, 23(1), pp.7-9.
  4. Svoboda, K., Schmidt, C.F., Schnapp, B.J. and Block, S.M., 1993. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature, 365(6448), p.721.
  5. Tassieri, M. ed., 2016. Microrheology with Optical Tweezers: Principles and Applications. CRC Press.
  6. Wilson, L., Matsudaira, P.T. and Sheetz, M.P., 1997. Laser tweezers in cell biology (Vol. 55). Academic Press.
  7. Greenleaf, W.J., Woodside, M.T. and Block, S.M., 2007. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 36, pp.171-190.
  8. Moffitt, J.R., Chemla, Y.R., Smith, S.B. and Bustamante, C., 2008. Recent advances in optical tweezers. Annu. Rev. Biochem., 77, pp.205-228.
  9. Perkins, T., 2009. Optical traps for single molecule biophysics: a primer. Laser & Photonics Reviews, 3(1-2), pp.203-220.
  10. Perkins, T., 2014., Angstrom-Precision Optical Traps and Applications, Annu. Rev. Biophys., vol. 43, pp. 279.
  11. Berg-Sørensen, K. and Flyvbjerg, H., 2004. Power spectrum analysis for optical tweezers. Review of Scientific Instruments, 75(3), pp.594-612.

Optical tweezers microscopes can be used in a variety of applications, not just those that inquire about position or force. Biological applications for tweezers systems include 2D surface patterning (such as the guiding of dendrite growth)1 and precise 3D micromanipulation of single cells (such as direct writing)2,3. Including a force module with the Thorlabs tweezer rig enables the acquisition of position and force measurements that are consistent with some popular assays found in published studies of molecular motors4 and single molecules5,6 such as DNA and proteins. The stress-strain relationships of cellular cytoskeleton networks (the viscoelastic properties related to the interior of single biological cells)7,8 can also be investigated.

In order to anticipate applications in which optical tweezer measurements can be successful, it is helpful to first appreciate how the physics (from instrument-to-sample) of position, time, and force act collectively to set constraints on what can or cannot be physically observed confidently within a given sample. Optical tweezers measurements in liquids rely on the thermal motion to drive bead displacements in the trap, so the detection of position changes in tweezers measurements are limited by that thermal noise. Researchers can tune that inherent physical noise in the sample to optimize the resolution and stability of a given measurement. Careful tuning of sample and instrument parameters thus work to build confidence toward the physical interpretation of the data and to qualify specific applications. 

When designing an experiment on a Thorlabs' tweezers system, the user selects the physical aspects of the probe bead, the solvent viscosity, the laser configuration, and other parameters in order to optimize performance.


Timescale-Bandwidth Considerations

For a single trapped particle, one first considers the minimum timescale tmin required to statistically resolve (at one sigma of statistical confidence, commonly known as the thermal-limit of bead statistics) a given minimum displacement xmin within a trap region described by constant stiffness κ:

One typically takes acquisitions longer than tmin in order to build confidence that one is sufficiently tuned-in to probe bead physics. For a silica bead of radius r in a moderately stiff trap of pure water (κ = 100 pN/mm, η = 0.001 kg·m-1·s-1, r = 5 x 10-7 m) at room temperature, one can expect a minimum of 4 ms of acquisition (sampled at 10 kHz) is needed to resolve a 1 nm position change. The reason a 10 kHz sample rate was chosen here is that one desires a sample rate minimally sufficient to capture enough frequency information for good curve-fitting of the power spectrum during the calibration of the given spring constant, and with consideration to Nyquist rate sampling. Sometimes obtained via an autocorrelation function, the characteristic frequency fchar and the characteristic time τ of the trap are both related to the ratio of the spring constant to the bead drag coefficient:

Characteristic Frequency


Position-Force Implications

Beyond basic tuning parameters, all tweezers measurement systems have some inherent drift over long times, so it also helps to look at a parameter called Allan variance to determine signal drift in the instrument’s position and force data9. The position error (derived from the Allan variance of position) σx_Allan and force error σF_Allan is related to half the averaged squared mean of neighboring positions: 


Error Derived from Allan Variance of Position and Force

By plotting these quantitites versus acquisition time for a single extended acquisition, one can find a best acquisition duration that minimizes position error σx. Allan variance is always a non-negative number and should only be calculated when the total acquisition time is greater or equal to the twice the characteristic time:

Total Acquisition Time

Allan variance can then be compared to the thermal limits of the experiment9,10. For an acquisition time ttotal averaged over several independent measurements N, the number of independent measurements can be related to the trap stiffness and the drag coefficient9,10:

Number of Independent Measurements Related to Trap Stiffness and Drag Coefficient

That equation along with the equipartition theorem:

Equipartition Theorem

leads to a standard “thermal limit” of position error:

Standard Thermal Limit of Error

Note, one can also re-cast that equation in terms of bandwidth (or sampling rate) to show that decreasing bandwidth minimizes position error11. However, a rate slightly higher than the corner frequency of the trap helps to achieve good curve-fitting slightly beyond the corner frequency.


Successful Application of Tuning Parameters

After addressing drift and basic tuning considerations, the positions of a probe bead can build confidence that subsequent physical properties derived from the calibrated sample will be physically meaningful. For example, the viscosity of the local fluid around the bead can then be determined by the following:

Viscosity of the Local Fluid around the Bead

with the characteristic time τ, temperature T, bead radius r, and the average bead-position-squared (x2). This viscosity calculation can be compared to viscosity results obtained from a curve-fitting procedure of the power spectrum. Then experimenters can begin to look at more fundamental questions about the local environment around the probe bead. For example, the local temperature of the fluid near the trap may slightly increase due to heating by the laser12. Bead radius typically has small variance from bead to bead in a given commercial batch. The ionic strength of some environments near the probe bead may be hard to assess, and this may affect local viscosity. Hydrodynamic drag from other nearby objects can affect the determination of viscosity.

The question for researchers becomes: how much uncertainty in microscopic physical parameters can one accept during an experiment, and what approaches are best to address these uncertainties with experimental design? To address the local environment near the probe bead, a 1064 nm laser, such as the one used in our tweezer systems, is smart choice because of its relatively low absorption by water. In some cases, this allows one to completely ignore temperature affects due to the laser. Also, fluid dynamics is a bulk theory, and researchers are actively trying to scale it down to the molecular domain. Similarly, another area of research aims to probe the interior of biological cells with tweezer probe beads in order to model the interior of the cell as a molecular stress-strain network. With a viscoelastic approach, optical tweezer position data can be used to explain physical properties (other than force) pertaining to storage and loss of energy within the material surrounding the probe bead. 

Such viscoelastic material response functions can be calculated from the tweezers' position time-series data. For a thorough review of the modeling opportunities that viscoelastic approaches afford, we urge the reader to consult Tassieri’s textbook listed in the references below, along with other listed journal articles on that subject. Thorlabs is happy to work with Optical Tweezers Microscope System customers to achieve custom designs toward these pursuits. Contact us, and we can adapt a software platform to investigate most of the popular load forces applied to a probe bead.


References

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Thorlabs' software is included for free when tweezers products are purchased. Tweezers system software can be customized to suit the client's analysis needs. Our software package consists of two core products that also integrate with an assortment of Thorlabs imaging and position acquisition modalities: Thorlmage®LS and ThorSync™. With ThorlmageLS, one can acquire camera images and move the stage simultaneously while acquiring position and force data via ThorSync. These modules are optimized to run on a high-performance rack-mountable architecture to address computation and memory load, which ensures that there is no system latency during force acquisitions. Images of standard layouts for ThorSync and ThorImageLS can be seen below.


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Figure 2: ThorImageLS - Optical Tweezer Microscope Module

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Figure 1: ThorSync - Optical Tweezer Microscope Module

Textbooks

Greulich, K.O., 2012. Micromanipulation by light in biology and medicine: the laser microbeam and optical tweezers. Springer Science & Business Media.
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Biophysics

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This optical tweezer simulation was made by Physics Education Technology (PhET) based at the University of Colorado Boulder (CU). It provides a sense of how optical tweezers are used in actual experiments. The JAVA™ applet simulates how a focused electric field from light waves creates the force which then controls probe bead displacement. The field vector magnitudes and directions in this applet are physically correct, and therefore useful for visualizing how force is related to the position of a probe bead in the tweezers. This applet was designed and tested by experts in optical tweezers, including Tom Perkins (who has published/invented some of the most sensitive force and position resolution experiments with tweezers at JILA).

This simulator has three tabs at the top of the screen: Physics of Tweezers, Fun with DNA, and Molecular Motors. The Physics of Tweezers tab aids in visualizing how electric field gradients can cause a force with electrically polarizable objects. Toggles on this screen allow the user to display vectors associated with electric fields in both the probe particle and the laser, which can be used to visualize the force that results from induced dipoles in dielectric particles like the ones used in testing (e.g., silica or polystyrene). The user can use their mouse to grab the particle, place it anywhere, and impose a fluid flow.


Posted Comments:
Fatemeh Jafariani  (posted 2020-06-23 08:13:58.117)
Hi, I want to know the price of "Optical Tweezers Microscope System"? Best,
YLohia  (posted 2020-06-23 08:42:16.0)
Hello, thank you for contacting Thorlabs. For a quote, please email ImagingSales@thorlabs.com or call (703) 651-1700.
Abdiel Pino  (posted 2020-03-06 12:36:35.953)
I need to know the cost of the Optical Tweezers Microscope System
llamb  (posted 2020-03-09 02:14:43.0)
Thank you for contacting Thorlabs. We will reach out to you directly. For future reference, you may contact ImagingSales@thorlabs.com directly for details and pricing.
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