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顕微鏡対物レンズ、走査レンズ、チューブレンズのチュートリアル


顕微鏡対物レンズ、走査レンズ、チューブレンズのチュートリアル


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対物レンズ、走査レンズ、チューブレンズの製品ラインナップはこちらからご覧いただけます。

対物レンズの表示


注:上の図は典型的な対物レンズの刻印ですが、こちらはあくまで例としてご参照ください。刻印されている仕様の書式や内容は、対物レンズごとに、もしくはメーカごとに異なります。
Magnification Color Codes
Immersion Media Color Codes

対物レンズの種類

当社では、様々な研究ニーズに合わせていくつかのタイプの対物レンズをご用意しています。ここでは、それぞれのタイプの対物レンズの特長と利点を説明します。

ドライ、液浸、in vivo観察用対物レンズ
ここでは対物レンズの先端とカバーガラスの間に存在する媒質について触れます。ドライタイプの対物レンズは、対物レンズと試料の間には空気を満たしていることを前提に設計されています。油浸対物レンズの場合、対物レンズと試料のカバーガラスの間にはMOIL-30のような液浸油を満たす必要があります。油浸はNAを1.0より大きくするために必要とされます。カバーガラス用水浸対物レンズ(Water Immersion)は対物レンズと試料の間に水滴入りのカバーガラスを使用する設計であるのに対し、in vivo観察用水浸対物レンズ(Water Dipping)は試料と直接接触する設計となっています。尚、液浸対物レンズやin vivo観察用対物レンズが媒質のない状態で使用された場合、像の品質は非常に低くなることにご注意ください。

プランアクロマートおよびプランアポクロマート対物レンズ
「プラン」とは対物レンズの視野にわたって平坦な像を作り出すための収差補正が行われたことを意味しています。また、「アクロマート」はレンズ設計において色収差の補正がなされていることを意味しています。こちらの対物レンズでは2つの波長に対する色収差補正と、1つの波長に対する球面補正がなされています。プランアクロマート対物レンズは緑の光に対して最も優れた像を作り出します。また、アポクロマート対物レンズは3~5の波長に対する色収差補正と、2~4の波長に対する球面収差補正がなされています。白色光を使用したカラー顕微鏡写真撮影の場合、プランアクロマート対物レンズは十分な像を作り出しますが、より補正がなされているプランアポクロマート対物レンズやプランフルオール対物レンズ(後述)には及びません。

プランフルオール(プランフルオリート)対物レンズ
プランフルオール対物レンズは、プランセミアポクロマート対物レンズや、プラン蛍光対物レンズ、プランフルオリート対物レンズとも呼ばれ、視野にわたって平坦な像を作り出します。プランフルオール対物レンズは、2~4波長において色収差、3~4波長において球面収差を補正します。プランアクロマート対物レンズよりも多くの波長において収差を補正した上、設計波長の間の波長範囲でも収差が少なくなっています。これらの対物レンズはカラー顕微鏡写真撮影の用途にも適しています。

スーパーアポクロマート対物レンズ
当社のスーパーアポクロマート対物レンズは可視域全体で軸上色収差が補正されています。これらの対物レンズでは、広い視野全体にわたり、ビネットの無い回折限界の軸上色性能が得られます。開口数(NA)が高いため、ワイドフィールド観察・撮像や光量の低い環境での使用に適しています。

用語解説

倍率(Magnification)
対物レンズの倍率はレンズチューブの焦点距離(L)を対物レンズの焦点距離(F)で割った値です。

M = L / F

システムの総合倍率は、対物レンズの倍率に接眼レンズまたはカメラチューブの倍率を乗じます。 顕微鏡用対物レンズ筐体に示されている仕様の倍率は、対物レンズを対応するチューブレンズの焦点距離でお使いになる限り正確です。

開口数(NA)
開口数は、対物レンズの最大受光角を表す無次元量です。一般的には下記の式で表します。

NA = ni × sinθa

θaは対物レンズの最大受光角度の半分(半角)、niは媒質の屈折率です。媒質は通常空気ですが、水や油、ほかの物質の場合もあります。

同焦点距離(Parfocal Length)
対物レンズ上部(取付けネジの底)からカバーガラス(カバーガラスを使用しない場合は、試料)までの距離です。同焦点距離は製造会社によって、また同じ会社の製品でも異なることがあります。例として、当社では同焦点距離が60 mmと90 mmの対物レンズを製造していますが、多くのOlympus製およびZeiss製対物レンズの同焦点距離は45 mm、Nikon製およびLeica製対物レンズの標準的な同焦点距離は60 mmです。また、同焦点距離が75 mmの特大対物レンズを製造しているメーカもあります。 同焦点距離が異なる対物レンズを使用する必要がある場合には、同焦点距離エクステンダもご用意しています。

作動距離(Working Distance)
対物レンズの先端からカバーガラスの近い方の面までの距離で、対物レンズの設計により異なります。対物レンズに刻印されているカバーガラスの厚さの仕様値によりカバーガラスを使用すべきかが分かります。


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このグラフは632.8 nmでの画質におけるカバーガラスの効果を示しています。

視野数(Field Number; FN)
視野数は、視野(mm単位)に対物レンズの倍率を乗じた数に相当します。

FN = Field of View Diameter × Magnification

カバーガラスの補正(Coverslip Correction)と補正リング(Correction Collar)
一般的なカバーガラスは、0.17 mmの厚みで設計されていますが、製造工程でのバラツキにより異なる場合があります。いくつかの対物レンズに付いている補正リング(カラー)は、内部の光学素子の位置を調整することにより厚さの違うカバーガラスに使用されます。尚、多くの対物レンズではカバーガラスの補正が可変ではありません(例えば、厚さ0.17 mmの標準のカバーガラスとのみ使用できる設計の対物レンズもあります)。その場合、対物レンズには補正リングは付いていません。

右のグラフは、632.8 nmの光における球面収差の大きさと使用するカバーガラスの厚さの関係を示しています。厚さ0.17 mmの一般的なカバーガラスを使用する場合、NA 0.40までの対物レンズではカバーガラスによる球面収差は回折限界を超えることはありません。

Widefield Viewing Optical Path
カメラで画像を表示する場合、システム倍率は対物レンズの倍率とカメラチューブの倍率の積です。三眼鏡筒で画像を表示する時のシステム倍率は、対物レンズの倍率と接眼レンズの倍率の積です。
Magnification & FOV Calculator
ManufacturerTube Lens
Focal Length
Leicaf = 200 mm
Mitutoyof = 200 mm
Nikonf = 200 mm
Olympusf = 180 mm
Thorlabsf = 200 mm
Zeissf = 165 mm

緑色の欄のメーカはf = 200 mmのチューブレンズを使用しておりません。

倍率と試料領域の計算方法

倍率

システムの倍率はシステム内の各光学素子の倍率の積で求めます。倍率のある光学素子には右図の通り、対物レンズ、カメラチューブ、そして三眼鏡筒の接眼レンズが含まれます。なお、各製品仕様に記載されている倍率は通常、すべて同じメーカの光学素子を使用した時のみ有効であることにご留意ください。同じメーカの光学素子を使用していない場合、システムの倍率は下記の通り、まず対物レンズの有効倍率を求めたあと算出する必要があります。

下記の例をお手持ちの顕微鏡に応用する場合には、上のMagnification and FOV Calculator(赤いボタンをクリック)をダウンロードしてご使用ください。こちらの計算用エクセルファイルはマクロを使用したスプレッドシートになっています。計算を行う際はマクロを有効にする必要があります。マクロを有効にするには、ファイルを開いて、上部にある黄色いメッセージバー上の「編集を有効にする」ボタンをクリックしてください。

例1:カメラの倍率
試料をカメラでイメージングする場合、イメージは対物レンズとカメラチューブによって拡大されます。倍率が20倍のNikon製対物レンズと倍率が0.75倍のNikon製カメラチューブを使用している場合、カメラの倍率は20倍 × 0.75倍 = 15倍となります。

例2:三眼鏡筒の倍率
三眼鏡筒を通して試料をイメージングする場合、イメージは対物レンズの倍率と三眼鏡筒内の接眼レンズによって拡大されます。倍率が20倍のNikon製対物レンズと接眼レンズの倍率が10倍のNikon製三眼鏡筒を使用している場合、接眼レンズでの倍率は20倍 × 10倍 = 200倍となります。なお、右図のように接眼レンズでの像はカメラチューブを通りません。

メーカが異なる対物レンズと顕微鏡を使用する場合

倍率は根源的な値ではなく、特定のチューブレンズの焦点距離を推定して計算し、導き出す値です。右の表のように各顕微鏡メーカはチューブレンズに様々な焦点距離を設定しています。そのため異なるメーカの光学素子を組み合わせる場合、システムの倍率を算出するには対物レンズの有効倍率を計算する必要があります。

対物レンズの有効倍率は式1で求められます。

Equation 1(Eq. 1)

ここでDesign Magnificationは対物レンズに印字されている倍率、fTube Lens in Microscopeは使用する顕微鏡内のチューブレンズの焦点距離、fDesign Tube Lens of ObjectiveはDesign Magnificationを算出するために対物レンズのメーカが使用したチューブレンズの焦点距離です。焦点距離は右表に記載されています。

Leica、Mitutoyo、Nikonならびに当社ではチューブレンズの焦点距離は同じです。これらのメーカの光学素子を組み合わせた場合、倍率の変換は必要ありません。対物レンズの有効倍率が算出されたら、上記のようにシステムの倍率が計算できます。

例3:三眼鏡筒の倍率(異なるメーカを使用)
三眼鏡筒を通して試料をイメージングする場合、イメージは対物レンズの倍率と三眼鏡筒内の接眼レンズによって拡大されます。この例では倍率が20倍のOlympus製対物レンズと接眼レンズの倍率が10倍のNikon製三眼鏡筒を使用します。

式1と右の表によりNikon製顕微鏡内のOlympus製対物レンズの有効倍率を下記の通り計算しました。

Equation 2

Olympus製対物レンズの有効倍率は22.2倍で、三眼鏡筒の接眼レンズの倍率は10倍なので、接眼レンズでの倍率は、22.2倍 × 10倍 = 222倍となります。


Image Area on Camera

カメラでイメージングする試料領域

試料をカメラでイメージングする場合、試料領域の寸法はカメラセンサの寸法とシステム倍率を使用して下の式2で求められます。

Equation 5(Eq. 2)

カメラセンサの寸法はメーカが提供しています。またシステム倍率は対物レンズの倍率とカメラチューブの倍率の積です(例1をご参照ください)。必要に応じ、対物レンズの倍率を例3のように調整します。

倍率が高くなればなるほど分解能も向上しますが、視野は狭くなります。倍率と視野の関係性については右の図でご覧いただけます。

例4:試料領域
当社のサイエンティフィックカメラ1501M-USB内のカメラセンサの寸法は8.98 mm × 6.71 mmです。このカメラを例1のNikon製対物レンズと三眼鏡筒に使用した場合、システム倍率は15倍となります。イメージングの領域は下記の通りになります。

Equation 6

試料領域例

下のマウス腎臓の画像はすべて同じ対物レンズとカメラを使用して取得しました。ただし、カメラチューブのみ違う製品を使用しています。左から右の画像にいくにつれカメラチューブの倍率が下がっていますが、視野が広くなる分、細部も小さくなり見にくくなることが分かります。

Image with 1X Camera Tube
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倍率1倍のカメラチューブで取得(型番 WFA4100)
Image with 1X Camera Tube
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倍率0.75倍のカメラチューブで取得(型番 WFA4101)
Image with 1X Camera Tube
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倍率0.5倍のカメラチューブで取得(型番 WFA4102)

走査レンズは共焦点レーザ走査型顕微鏡、光コヒーレンストモグラフィ(OCT)、多光子イメージングシステムほか様々なレーザーイメージングシステムに使用されています。これらの用途では、レンズの後方開口部(入射瞳)から入射したレーザ光が角度走査されます。これにより、レンズの視野内の結像面に形成されたスポットが移動します。テレセントリックレンズ以外のレンズを使用して像面の焦点を走査すると、顕著な収差が引き起こされ、生成画像の画質は著しく損なわれます。テレセントリック走査レンズは、各走査位置において均一なスポットサイズを生成するので、高画質な試料像が得られます。スポットサイズならびに走査位置と走査角度の関係を示したグラフは、「仕様」タブでご覧いただけます。

一般的に、レーザ走査顕微鏡システムは走査レンズとチューブレンズを対で使用し、無限遠補正の光学システムを構築します。しかし多くのOCTシステムは、チューブレンズ無しで走査レンズを使用する設計です。レンズ CLS-SLSL50-CLS2SL50-2P2そしてSL50-3Pは、当社の共焦点レーザ型走査顕微鏡ならびに多光子顕微鏡システム向け、そしてLSMシリーズのレンズはOCTイメージングシステム向けに最適化されています。走査システムにおけるチューブレンズの有無については後述しています。

Scan and Tube Lens Integration
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上の図はチューブレンズTL200-2P2 と焦点距離200 mmのテレセントリックチューブレンズを使用した場合のレンズ間の距離を示しています。なおSL50-CLS2を使用した場合、走査面における入射瞳は最大Ø4 mmとなります。

一般的なレーザ走査顕微鏡に組み込んだ走査レンズ

右の図ではレーザ走査顕微鏡における走査レンズとチューブレンズ間の適切な距離を示しています。図の左側の走査面に位置する走査ミラーは、レーザービームを走査レンズに誘導します。走査レンズへの入射角度により、走査レンズとチューブレンズITL200の間に位置する中間の像面の焦点位置が決まります。チューブレンズは光を収集し、コリメートする位置にあります(無限焦点)。コリメート光は対物レンズを通り、試料面で焦点を結びます。試料面で散乱または放射された光は対物レンズにより集光され、ディテクタに誘導されます。左下の画像では走査レンズCLS-SLをチューブレンズとともに使用しています。画像をクリックするとCLS-SLとチューブレンズITL200を使用した場合の正確なレンズ間の距離がご覧いただけます。

この光学システム設計の特長は、走査レンズとチューブレンズを組み合わせることによってコリメート光が生成されることです。チューブレンズの光が無限遠で集光されるため、チューブレンズに対する対物レンズの位置を移動させても、試料面での画質には影響がありません。 これにより光学システムを高い柔軟性で設計することが可能となります。チューブレンズを使用しない場合、走査レンズは対物レンズと同様に機能し、中間の像面は試料面となります。画質を維持したまま走査レンズに対して像面の位置を大きく動かすことは非常に困難です。

右下では、走査距離とチューブレンズと対物レンズの間の距離の関係性について図で示しています。完全な4f光学系(例としてCLS-SLを使用)において、d1 = 52 mm(最小走査距離)ならびにd2 = f2です。しかし実際のシステムはこの完全なアライメントから若干逸脱しています。例えば多くの市販の顕微鏡では、チューブレンズと対物レンズの間の距離(d2は、焦点距離(f2)と等しくはありません。よって距離の調整が必要になる場合があります。右下の図では走査距離とチューブレンズと対物レンズの間の距離がそれぞれδ1ならびにδ2と少しずつ移動していることを示しています。これらの値の関係性はδd1 = -δd2*(f1/f2)2です。

CLS-SL Schematic
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チューブレンズCLS-SLをITL200と対物レンズとともに組み込んだレーザ走査システム。
CLS-SL Schematic
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一般的なレーザ走査システムでのレンズ配置。

OCTシステムに組み込んだ走査レンズ

LSM走査レンズを使用したOCTイメージングシステムの設計で重要な点ですが、設計波長、同焦点面距離、走査距離、入射瞳寸法や走査角度を考慮して使用すると画質が最大限に向上できます(走査レンズの仕様や用語の定義については「仕様」タブをご参照ください)。 一般的に入射ビーム径が大きくなると焦点サイズは小さくなります。しかし、ビネット効果や収差の増大によりビーム径が大きくなるにつれ、走査角度の範囲は狭くなります。ビーム系が入射瞳寸法より小さい場合スポットサイズは「仕様」タブ内に記載された値よりも大きくなり、逆に径が寸法より大きい場合はビームが蹴られてしまいます。

ガルバノミラーが1つしかないイメージングシステムでは、走査レンズの入射瞳の中心は、ガルバノミラーの回転軸と一致していなければなりません。ガルバノミラーを1つだけ使用する場合、走査距離はレンズの取付け面からミラーの回転軸までの測定距離となります。これは左下の図で示されています。

イメージジングシステム内にガルバノミラーが2つある場合は(1個はX方向の走査用、もう1個がY方向走査用)、右下の図のように入射瞳が2つのガルバノミラーの間に位置する必要があります。この場合、走査距離は、レンズの取付け面からレンズ(d1)に近い方のミラーの回転軸に、このミラーの回転軸から入射瞳までの距離(d2)を加えた値になります。ここで重要なのは2個のガルバノミラーの間の距離が最小であることです。入射瞳とビームステアリングのピボットポイントが一致していない場合、イメージ品質は劣化します。この現象の主な原因は、試料上をスキャンするビーム光の光路長のバラツキです。下図はイメージングシステムにおいて、ガルバノミラーが1個の場合と2個の場合を示しています。

2d galvo mirror schematic
ガルバノミラーを1つだけ使用した場合、入射瞳はミラーの回転軸の位置にきます。
1d galvo mirror setup
ガルバノミラーを2つ使用した場合、入射瞳のはミラーとミラーの間に位置します。

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