2光子顕微鏡用波長可変フェムト秒Ti：サファイアレーザ

Click to Enlarge

2光子イメージングによる構造の洞察

多光子顕微鏡は、生体組織の近赤外域透過ウィンドウと高度な局在励起を利用して、3次元ボリュームのマルチチャンネル蛍光イメージを生成します。近赤外域光は、市販の広視野顕微鏡や共焦点顕微鏡に使用される可視光と比べて生体化合物による散乱や吸収が非常に少ないため、より深部の画像を得ることができます。

右のミバエの目の画像は、形態学的特徴を識別できるTiberiusの能力を実証しています。この2チャンネルイメージは、GFPで標識された光受容体部分と、多光子自家蛍光を示す標識されていない部分で構成されています。励起波長は770 nmで、Olympus社製の25倍対物レンズ(NA 1.05)を使用しました。

Click to Enlarge
Tiberiusを制御するためのGUIが付属します。

多光子イメージング用フェムト秒Ti：サファイアレーザ

• 720 nm～1020 nmの広いチューニングレンジ
• 業界トップレベルのチューニング速度：＜50 msで最大200 nmまでのチューニングが可能
• 高い出力パワー：800 nmにて＞2.0 W
• パルスの広がりを抑える＜120 fsの超短パルス
• 他社製レーザの半分の設置面積
• 工業用グレードのファイバ励起レーザによる長期安定性が非常に低い維持費を実現
• 内蔵の分光器によるリアルタイム診断
• ドライエアサーキュレーターユニットがレーザ共振器をパージするため、水の吸収線を通してもスムーズなチューニングが可能

一般的な用途

• マルチチャンネルの3次元ボリューム蛍光イメージ
• 光刺激およびアンケージング
• 多光子自家蛍光およびSHGによる無標識イメージング

波長可変フェムト秒Ti：サファイアレーザ Tiberius^®は、当社のライフサイエンス・アプリケーション専門家の協力を得て設計されています。製造は、光学設計や精密機器製造の高度な専門技術を活用して社内で行われています。詳細は「設計と製造」のタブをご覧ください。

この多光子イメージングレーザは、800 nmにおいて2.0 W以上の平均出力パワーを有し、中心波長は720 nm～1020 nmの範囲でチューニング可能です。この300 nmの広いチューニングレンジにより、特殊な化合物に多光子蛍光イメージングや光刺激/アンケージングを行うことができます。チューニング曲線は「仕様」タブでご覧いただけます。また、Tiberiusの波長チューニング速度や、それによって向上する画像コントラストについては、「高速チューニング」タブ内で動画など詳細をご覧いただけます。

Tiberiusレーザは、パルス幅120 fsのレーザを出射します。このスペクトル帯域幅が比較的狭いパルスは、2光子励起用に高いピーク強度を維持しながらポッケルスセルおよびその他の分散素子によるパルスの広がりを減少させるために使用されます。

狭いテーブル面積を有効活用するため、Tiberiusレーザの共振器は垂直方向に形成され、光学テーブル上の占有面積を最小限に抑える設計になっています。746 mm x 175 mmの設置面積は他社製品の約半分となっており、他の実験セットアップを置くスペースを確保できます。各レーザにはレーザーコントローラ、励起用レーザーコントローラ、チラー、そしてドライエアーサーキュレーターユニット(PACU)で付属します。

Tiberiusには、レーザ駆動用に直観的操作が可能なGUIが付属します。上の図に示したように、GUIがレーザの中心波長ならびに出力パワーをレポートします。測定には内蔵の分光器を使用し、スペクトルの位置と形状をリアルタイムで診断しています。プログラミングが可能なボタンは、よく使用する励起波長にワンクリックでアクセスできるようになっています。また、C、LabVIEW™およびMATLAB^®をサポートするSDKが付属しています。TiberiusはThorImage^®LSと完全に一体化しているので、光活性化実験やライブでの高速イメージングにおいてシームレスな同期制御を行うことができます。

社内の専門家による設計と製造

Tiberius^®は、当社の多分野にわたる経験豊富な設計エンジニアチームと、垂直統合型企業の充実したインフラ基盤によって完全に社内で製造されています。当社のレーザ部門は、Tiberiusの製造、組立ておよび試験における全工程を制御しているため、レーザの安定性と信頼性が保障されています。

このレーザのデザインは、共振器の複雑な理論的シミュレーションと従来型のプロトタイピングを組み合わせた成果です。共振器内のレーザ性能を熟知することで、非線形イメージングに関する特殊なご要望に合わせてレーザを最適化することができています。

精密オプトメカニクス製品製造
Tiberius^®の製造には、当社の25年以上にわたる精密フォトニクスコンポーネント製造およびアセンブリの経験が活かされています。例えば、OEMカスタム仕様のニーズや工業用グレード用途に合わせて開発を進めてきた高い性能と安定性を有するPolaris^® 設計が最大限に活用されています。この専門的な設計は、熱によるドリフトを抑え、長期的に安定したアライメントを実現しています。

Tiberiusレーザ共振器の2次元数値モデル

当社では、高度に垂直統合された社内システムによって、低価格、高性能のレーザをご提供しています。

最適化された超短パルスレーザ用光学素子
Tiberiusが高い光学性能を発揮するには、レーザ共振器や光学素子を1つのユニットとして最適化することが重要です。光学コーティングは社内で設計され、当社の共振器の独自デザインに精密に調整されるため、多光子顕微鏡に必要な長期安定性と幅広いチューニングレンジを有しています。

このような高性能コーティングを製造するために、あらゆるコーティング方法の中で最も精密な成膜制御と高密度コーティングを実現できるイオンビームスパッタ(IBS)を使用しています。このような特長により、高い損傷閾値を有し、環境要因の影響を受けにくく、ロットごとの性能が安定しているコーティングが実現しました。当社では、Tiberiusの重要な構成部品を製造するために多数のIBS機が稼働しています。

Improved Image Contrast with Fast Tuning

With an industry-leading tuning speed of up to 200 nm in <50 ms, the Tiberius^® is ideal for fast sequential imaging. The Tiberius' fast-tuning capability provides high-contrast images when used in multi-color, multiphoton microscopy applications.

Quickly switching between two optimized excitation wavelengths has several benefits over single-wavelength excitation. These include the much higher image contrast provided by fast switching and being able to maximize fluorescence at lower excitation powers, which reduces the risk of photobleaching.

Figures 1 and 2 illustrate the increased contrast enabled by imaging multiple fluorophores in a sample using fast sequential imaging.^† The sample is a 25 µm thick sagittal section of an adult rat brain. The red channel corresponds to fluorescence from chick anti-neurofilament that is optimally excited at 835 nm, while the green channel corresponds to fluorescence from mouse anti-GFAP that is optimally excited at 750 nm. Figure 1 shows fluorescence from single-wavelength excitation at 788 nm, which sub-optimally excites the two tags simultaneously. Figure 2 is a composite image of the fluorescence from a two-color excitation imaging sequence at 7 fps by fast tuning between 750 nm and 835 nm, which excites both tags optimally.

The video in Figure 3 shows the fast switching between the red and green fluorescence in both real time and at 1/16^th the imaging rate, which makes it easier to see the details of each. The two-channel set was collected at an imaging rate of 7 fps with a resolution of 512 x 512 pixels. The Tiberius' fast tuning functionality integrates seamlessly into ThorImage^®LS software, enabling synchronized control for photoactivation experiments and live high-speed imaging on millisecond timescales using the same laser.

^†This immunofluorescence sample was prepared by Lynne Holtzclaw of the NICHD Microscopy and Imaging Core Facility, a part of the National Institutes of Health (NIH) in Bethesda, MD.

Click to Enlarge
Figure 2. Fast Switching between the optimal excitation wavelengths of 750 nm and 835 nm provides the high contrast seen in this composite image. The two-channel set was collected at an imaging rate of 7 fps.^†

Click to Enlarge
Figure 1. The above image was acquired using single-wavelength excitation at 788 nm, while the optimum excitation wavelengths for the two tags are 750 nm and 850 nm.^†

レーザの安全性と分類

レーザを取り扱う際には、安全な操作の実施と、安全に関わる器具や装置を適切に取扱い、使用することが重要です。 ヒトの目は損傷しやすく、レーザ光のパワーレベルが非常に低い場合でも起こります。 当社では豊富な種類の安全に関わるアクセサリをご提供しており、そのような事故や負傷のリスクの低減にお使いいただけます。 可視域から近赤外域のスペクトルでのレーザ発光ではヒトの網膜に損傷与えうるリスクは極めて高くなります。これはその帯域の光が目の角膜やレンズを透過し、レンズがレーザーエネルギを、網膜上に集束してしまうことがあるためです。

安全な作業および安全に関わるアクセサリ

• 当社では、わずかでも影響のあるレベルのレーザ光線(例：クラス 1よりも高いクラスのレーザ機器)を取り扱う場合は、ネジ回しなどの金属製の器具が偶然に光の方向を変えて再び目に入ってしまうこともあるので、レーザ保護眼鏡を必ずご使用いただくようにお勧めしております。
• 特定の波長に対応するように設計されたレーザ保護眼鏡は、装着者を想定外のレーザ反射から保護するために、レーザ使用装置の近くのわかりやすい場所に置いてください。
• レーザ保護眼鏡には、保護機能が有効な波長範囲およびその帯域での最小光学濃度が刻印されています。
• 遮光用材料は、直接光と反射光の両方を実験装置の領域に封じ込めて外に逃しません。
• また当社の筺体システムは、その内部に光学セットアップを収納し、レーザ光を封じ込めて危険性を最小限に抑えます。
• ピグテール付き半導体レーザは、他のファイバに接続、もしくは他のファイバから取り外す際には、レーザ出力をOFFにしてください。パワーレベルが10 mW以上の場合には特にご注意ください。
• いかなるビーム光も、テーブルの範囲で終端させる必要があります。また、レーザ使用中には、研究室の扉は必ず閉じていなければなりません。
• レーザ光の高さは、目線の高さに設定しないでください。
• 全てのレーザビームが水平を保って直進するように、実験は光学テーブル上で行ってください。
• ビーム光路の近くで作業する人は、光を反射する不要な装飾品やアクセサリ(指輪、時計など)をはずしてください。
• レンズや他の光学装置が、入射光の一部を、前面や背面で反射する場合がありますのでご注意ください。
• あらゆる作業において、レーザは必要最小限のパワーで動作するようにご留意ください。
• アライメント作業は、可能な限りレーザの出力パワーを低減して行ってください。
• ビームパワーを抑えるためにビームシャッタやフィルタをお使いください。
• レーザのセットアップの近くや実験室には、適切なレーザ標識やラベルを掲示してください。
• クラス3Rやクラス4のレーザ(安全確保用のインターロックが必要となるレーザーレベルの場合)で作業する場合は、適切な警告灯などをご用意ください。
• 適切なビームトラップを用い、代用品としてレーザービュワーカードを使用したりしないでください。

レーザ製品のクラス分け

レーザ製品は、目などの損傷を引き起こす可能性に基づいてクラス分けされています。 国際電気標準会議(The International Electrotechnical Commission 「IEC」)は、電気、電子工学技術関連分野の国際規格の策定及び普及を行う国際機関で、 IEC60825-1はレーザ製品の安全性を規定するIEC規格です(対応するJIS規格はJIS C 6802)。レーザ製品のクラス分けは下記の通りです:

Class	Description	Warning Label
1	ビーム内観察用の光学機器の使用を含む、通常の条件下での使用において、安全とみなされているクラスです。 このクラスのレーザ製品は、通常の使用範囲内では、人体被害を及ぼすエネルギーレベルのレーザ光を放射することがないので、最大許容露光量(MPE)を超えることはありません。 このクラス1のレーザ機器には、レーザをシャットダウンするか、筐体等を開かない限り、作業者がレーザに露光することがないような、完全に囲われた高出力レーザも含まれます。
1M	クラス1Mのレーザは、安全であるが、望遠鏡や顕微鏡と併用した場合は危険な製品です。この分類に入る製品からのレーザ光は、直径の大きな光や拡散光を放射し、ビーム径を小さくするために光を集光する光学素子やイメージング用の光学素子を使わない限り、通常はMPEを超えることはありません。 しかし、光を再び集光した場合は危険性が増大する可能性があるので、このクラスの製品であっても、別の分類に移動する場合があります。
2	クラス2のレーザ製品は、その出力が最大1 mWの可視域での連続放射光に限定されます。瞬目反射によって露光が0.25秒までに制限されるので、安全と判断されるクラスです。 このクラスの光は、可視域(400～700 nm)に限定されます。
2M	このクラスのレーザ製品のビーム光は、瞬目反射があるので、光学機器を通して見ない限り安全であると分類されています。 このクラスは、レーザ光の半径が大きい場合や拡散光にも適用されます。
3R	ビーム内観察を行わなければ、このクラスのレーザ製品は安全とみなされます。 このクラスでは、MPE値を超える場合がありますが、被害のリスクレベルは低いクラスです。 可視域の連続波のレーザの出力パワーは、このレベルでは5 mWまでとされています。
3B	クラス3Bのレーザは、直接ビームを見た場合に危険なクラスです。 ただし、拡散反射は有害ではありません。 このクラスで装置を安全に操作するには、ビームを直接見る可能性のあるときはレーザ保護眼鏡を装着する必要があります。さらに、インターロック機能付きの自動表示灯等の警報装置を設け、それらがONにならない限り、レーザがONにならないようにすることが求められます。 クラス3Bのレーザ機器には、キースイッチと安全保護装置が必要です。
4	このクラスのレーザは、皮膚と目の両方に損傷を与える場合があり、これは拡散反射光でも起こりうるとみなされています。 このような被害は、ビームが間接的に当たった場合や非鏡面反射でも起こることがあり、艶消し面での反射でも発生することがあります。 このレベルのレーザ機器は細心の注意を持って扱われる必要があります。 さらに、可燃性の材質を発火させることもあるので、火災のリスクもあるレーザであるとみなされています。 クラス4のレーザには、キースイッチと安全保護装置が必要です。
全てのクラス2以上のレーザ機器には、上記が規定する標識以外に、この三角の警告標識が表示されていなければいけません。